摘要：目的探讨*连、干姜有效成分小檗碱、6-姜烯酚单独和联合应用对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞Notch信号通路的影响。方法50只昆明小鼠随机选取10只为对照组，其余40只采用2%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导溃疡性结肠炎模型。成模后随机分为模型组、小檗碱组、6-姜烯酚组、小檗碱＋6-姜烯酚组，ig给予相应药物，给药20d后取结肠组织。免疫荧光法检测结肠上皮组织Hes-1、Math-1、MUC2、人类嗅素蛋白（olfm4）的表达，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Westernblotting法检测结肠上皮组织Notch-1、Hes-1、Math-1mRNA和蛋白的表达。结果与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1蛋白和mRNA表达水平显著降低，Math-1蛋白和mRNA表达水平显著升高，olfm4蛋白表达显著降低，MUC2蛋白表达水平显著升高；3组间比较，小檗碱＋6-姜烯酚组作用最明显。结论6-姜烯酚、小檗碱均能够有效修复受损结肠黏膜，治疗溃疡性结肠炎，小檗碱和6-姜烯酚联合应用药效优于单独应用，其机制与抑制Notch通路的过度活化进而调节结肠上皮细胞增殖和分化相关。
溃疡性结肠炎（UC）是一种以结肠黏膜损伤为主要病理表现的肠道免疫炎症性疾病，结肠黏膜的持续损伤是导致该病反复发作、迁延难愈的主要原因，而长期的结肠炎症又是诱发结肠癌的重要高危因素，流行病学显示，我国结肠炎和结肠炎相关肠癌的发病率呈逐渐上升趋势[1-2]，因此促进受损结肠黏膜修复是治疗UC防止其癌变的关键。近年来研究表明Notch信号通路是参与胃肠道黏膜修复的经典细胞间信号通路，该通路主要具有调节结肠上皮细胞增殖和分化的作用，尤其是在肠道干细胞向杯状细胞的分化中起着决定性作用，而杯状细胞的减少是导致UC发生、发展的重要原因之一[3]。
寒热并用法是中医药治疗UC临床常用治法[4-6]，干姜-*连是体现寒热并用法的主要药对之一，该药对具有抑制黏膜损伤、治疗UC的作用[7-9]。研究表明干姜的有效成分6-姜烯酚具有修复受损胃肠道黏膜的作用[10-11]，*连的有效成分小檗碱是抑制炎症反应的经典单体化合物[12]，为进一步明确2种单体配伍后修复受损结肠黏膜的作用和机制，本实验研究了小檗碱和6-姜烯酚联合应用对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞Notch信号通路的影响及作用机制，为寒热药物并用提供科学依据。
1材料
1.1实验动物
清洁级雄性昆明小鼠50只，体质量（20±5）g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号SCXK（陕）-。
1.2药品与试剂
6-姜烯酚（批号）、小檗碱（批号），购于宝鸡市辰光生物科技有限公司，质量分数均为98%；葡聚糖硫酸钠（DSS，批号，美国MPBiomedicals公司）；RNA提取试剂盒、cDNA合成SuperMix试剂盒、PCRSuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；Notch-1、Hes-1、Math-1、人类嗅素蛋白（olfm4）、MUC2抗体（博奥森生物技术有限公司）；引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）。
1.3仪器
SuperMiroSM-超微量分光光度计（英国Biochrom有限公司）；IANLONGRealTimePCR（qRT-PCR）系统（西安天隆科技有限公司）；4℃离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）。
2方法
2.1动物分组、造模及给药
50只小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组10只和造模组40只，DSS诱导小鼠结肠炎模型。将DSS配制成2%的混悬液，造模组小鼠自由饮用，约10d后小鼠逐渐出现腹泻、黏液脓血便、饮食量减少等症状，继续饮用至15d，模型复制成功。将40只造模小鼠随机分为模型组、6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组。模型复制成功后ig给药，6-姜烯酚组及小檗碱组分别给予mg/kg6-姜烯酚、mg/kg小檗碱[13]；小檗碱＋6-姜烯酚组给予小檗碱和姜烯酚各mg/kg，模型组和对照组均ig给予等量生理盐水，连续给药20d。
2.2结肠病理学组织观察
取病变部位结肠组织，10%甲醛固定24h，梯度酒精脱水，浸蜡，组织切片，脱蜡，HE染色，光镜下观测组织形态学改变。
2.3免疫荧光双标法检测结肠组织Hes-1、Math-1蛋白表达
冰冻切片血清1∶20室温封闭20～30min，加入Hes-1、Math-1一抗4℃过夜。二抗分别为FITC和CY3标记的抗一抗种属来源抗体，37℃孵育1h；90%甘油封片，荧光显微镜下观察。
2.4免疫荧光单标法检测结肠上皮组织olfm4、MUC2蛋白表达
普通石蜡切片3%H2O2室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min×2，5%～10%山羊血清封闭，室温孵育10min，一抗4℃过夜，荧光二抗37℃孵育10～30min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后荧光显微镜下观察。
2.5qRT-PCR方法检测Notch-1、Hes-1、Math-1mRNA表达
取结肠上皮组织，按照RNA试剂盒说明书提取总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA纯度；根据RNA浓度进行以Oligo（dT）为引物将RNA反转录为cDNA，并检测cDNA浓度，按照qRT-PCR试剂盒说明书条件（引物序列见表1）检测Notch-1、Hes-1、Math-1mRNA的表达量，相对定量法计算各指标mRNA的ΔCt值。
2.6Westernbloting法检测结肠上皮组织Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表达
取结肠上皮组织，制备组织匀浆，裂解结肠组织标本，提取总蛋白，BCA定量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移至尼龙膜，5%奶粉封膜4℃过夜，一抗4℃过夜，二抗常温孵育1h，化学发光法检测目的条带，压X光片曝光，ImageJ软件分析相应蛋白条带的灰度值。
2.7统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析，数据以表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
3结果
3.1小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠一般情况及结肠黏膜的影响
对照组小鼠一般情况良好，饮食量、饮水量均正常，肉眼观结肠黏膜表面光滑，富含黏液，组织纹理清晰。模型组小鼠饮食量、饮水量较对照组明显减少，形体消瘦，喜扎堆，弓背，毛色发*无光泽，肛周污浊，可见红色血液样黏液分泌，肉眼可见结肠病变部位组织增厚，黏膜充血、水肿，出现糜烂或溃疡点。6-姜烯酚组小鼠饮食量、饮水量增多，肛周污浊仍可见红色黏液分泌、结肠肠壁的增厚程度、黏膜的充血水肿及糜烂、溃疡等情况均较模型组有所减轻。小檗碱组小鼠饮食量、饮水量未见明显变化，肛周红色黏液分泌减少，肉眼可见结肠病变部位组织增厚，黏膜充血、水肿，糜烂或溃疡点明显减少。小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠饮食量、饮水量显著增加，肛周未见红色黏液分泌，肉眼可见结肠病变部位组织修复瘢痕形成，黏膜轻微水肿，未见明显糜烂或溃疡。
3.2小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠组织形态学影响
HE染色结果（图1）显示，对照组小鼠结肠组织结构正常，腺体排列整齐，黏膜上皮组织完整，黏液层正常。模型组小鼠结肠组织结构异常，黏膜表面出现缺损，黏液层部分丢失，大量炎细胞聚集，浸润，腺体破坏甚至丢失。6-姜烯酚组小鼠结肠组织结构基本恢复正常，黏膜缺损明显减轻，受损部位可见少量炎性细胞。小檗碱组小鼠结肠组织结构基本正常，黏膜缺损减轻，炎症部位炎性细胞明显减少。小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠组织结构基本恢复正常，未见明显黏膜缺损，未见明显炎性细胞浸润。
3.3小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠上皮组织Hes-1、Math-1蛋白表达的影响
免疫荧光双标法染色结果（图2）显示，对照组小鼠结肠组织Hes-1（红色）、Math-1（绿色）蛋白均呈现低表达。与对照组比较，模型组小鼠结肠上皮Hes-1蛋白表达水平明显升高，Math-1蛋白表达水平降低。与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠组织Hes-1蛋白表达水平降低，Math-1蛋白表达水平升高。其中小檗碱＋6-姜烯酚变化最明显。
3.4小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠上皮组织MUC2蛋白表达的影响
免疫荧光单标染色结果（图3）显示，对照组小鼠结肠组织MUC2蛋白（红色）呈高表达。与对照组比较，模型组小鼠结肠组织MUC2蛋白表达水平明显降低。与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠组织MUC2蛋白表达水平升高，其中小檗碱＋6-姜烯酚组变化最明显。
3.5小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠上皮组织olfm4蛋白表达的影响
免疫荧光单标染色结果（图4）显示，对照组小鼠结肠组织olfm4蛋白（绿色）呈低表达。模型组小鼠结肠组织olfm4蛋白表达水平明显升高。与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠组织olfm4蛋白表达水平降低，其中小檗碱＋6-姜烯酚组olfm4蛋白表达水平降低最明显。
3.6小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1、Math-1mRNA表达的影响
qRT-PCR结果（表2）显示，与对照组比较，模型组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）、Math-1mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），Math-1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与小檗碱＋6-姜烯酚组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；Math-1mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。
3.7小檗碱与6-姜烯酚配伍对结肠炎小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表达的影响
Westernblotting结果（图5）显示，与对照组比较，模型组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）、Math-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组、小檗碱＋6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Math-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与小檗碱＋6-姜烯酚组比较，6-姜烯酚组、小檗碱组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Math-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。
4讨论
免疫炎症导致的肠道黏膜持续性损伤是UC不断进展的主要原因[14]，因此控制免疫炎症和促进黏膜修复是治疗UC的主要策略，现代医学对UC的治疗主要以氨基水杨酸、激素、硫嘌呤类、生物制剂等控制免疫炎症的药物维持为主，虽然抑制免疫炎症有利于促进黏膜组织的修复，但其作用有限，而临床尚无能够明确促进黏膜修复的药物，目前UC的治疗目标是维持临床和内镜的无激素缓解[15]。因此，寻找既能有效抑制免疫炎症，又能促进受损黏膜组织修复的药物是目前防治UC的重点和难点。研究表明Notch信号通路调控了细胞的增殖、分化和凋亡，而细胞的增殖、分化和凋亡的失常是导致组织损伤、炎症加剧、肿瘤细胞生长的重要原因，这一结果提示Notch信号通路参与了结肠上皮组织的修复以及炎症的持续性进展[16]。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和DNA结合蛋白3部分组成，其主要作用是调控胚胎发育和细胞分化，保持组织器官体内稳态。在哺乳动物体内，有4种Notch受体（Notch1～4），广泛的分布于人体的淋巴细胞、血管内皮细胞、肠上皮细胞中，其中Notch-1主要分布在肠道中[17]。Notch配体与受体结合后，释放出和Notch配体连接的胞外部分，随后在γ-分泌酶的作用下，与转录抑制因子RBP-J结合，调节靶基因表达，发挥生物学效应。Notch-1通过其下游的Hes-1、Math-1、olfm4调控结肠上皮细胞的增殖和分化，决定着结肠上皮细胞特别是杯状细胞的命运[18]，其中olfm4是促进结肠上皮细胞增殖的靶蛋白，Hes-1是促进增殖的细胞向吸收细胞系转化的靶蛋白，Math-1促进增殖的细胞向分泌细胞转化的靶蛋白（主要是杯状细胞），而杯状细胞的缺失不但会造成结肠上皮组织的缺损，其分泌的黏蛋白MUC2、三叶因子多肽、抵抗素样因子等具有防御作用的物质减少，进一步引起黏膜屏障功能的减退[19-20]，造成疾病的反复发作、迁延难愈。Notch信号通路不但能调控结肠上皮细胞的增殖和分化，还可作用于肠道巨噬细胞，抑制肠道非可控性炎症[21-22]，因此Notch被认为是促进受损结肠黏膜修复，治疗UC的潜在靶点。
干姜-*连是中医药治疗UC临床常用的药对之一，实验研究表明干姜的有效成分6-姜烯酚是其发挥药效的主要活性成分之一，具有抗肿瘤[23]、抗氧化[24]、抗炎[25]、抑制幽门螺旋杆菌[26]、抑制血管平滑肌增殖[27]等多重效应，而最近的研究结果证实6-姜烯酚还能促进肠道受损黏膜组织的修复[13]，小檗碱是已经应用于临床治疗肠道炎症性疾病的有效药物[28]，近年来研究发现其在能够调血脂、保护心血管、通过影响大脑内神经递质发挥抗焦虑作用、增加胰岛素敏感性来治疗糖尿病，在预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、消化道疾病等重大疾病方面有着不可低估的应用前景[29]。本实验研究表明，小檗碱、6-姜烯酚、小檗碱＋6-姜烯酚均能有效调节肠道上皮组织Notch信号通路的过度活化，通过抑制Notch-1受体的表达进而抑制Hes-1蛋白的表达，最终作用于下游的olfm4靶蛋白，抑制结肠上皮细胞的过度增殖；促进Math-1的表达，从而促进增殖肠道上皮细胞向分泌细胞系（杯状细胞）分化，杯状细胞增多，促进结肠黏膜受损部位的修复，其分泌的MUC2黏蛋白亦逐渐增多，肠道黏膜屏障中的黏液屏障逐渐恢复，最终达到修复受损黏膜的药理作用，且小檗碱＋6-姜烯酚的作用高于小檗碱、6-姜烯酚的单独应用。
综上所述，小檗碱、6-姜烯酚分别是*连、干姜的治疗UC的有效成分之一，这2种有效成分具有调节结肠上皮细胞增殖和分化的作用，其药理机制与调节Notch信号通路的过度活化有关。这2种有效成分的联合应用药效显著优于单独应用。本研究只是从结肠黏膜修复的层次揭示了小檗碱联合6-姜烯酚的作用机制，其是否在抑制免疫炎症方面也有相类似的作用，还需要进一步探索。
参考文献（略）
来源：惠毅，闫曙光，李京涛，魏海梁，单宇鹏.小檗碱与6-姜烯酚配伍对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞Notch信号通路的影响[J].中草药,,50(13):-.
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