导语
淋巴瘤是一组起源于淋巴造血系统的类型复杂的恶性肿瘤总称。在我国，淋巴瘤每年新发病例约10万，已被列入10大高发及死亡率肿瘤行列。值得欣慰的是，近年来随着医学研究的不断进步以及新的治疗手段的不断涌现，淋巴瘤的治疗效果逐渐提高。
也正是因为治疗手段的多样，“没有明确诊断就没有准确治疗”的概念，在淋巴瘤的治疗中更显突出，如何通过病理诊断确定病理类型，从而指导淋巴瘤治疗方案的选择，成为了摆在病理医生面前的难题。无怪乎高子芬教授曾风趣地总结到：“好好一个病理大夫，让淋巴瘤毁了”。今天，高子芬教授将以B细胞淋巴瘤为开始，向我们介绍其病理诊断和分子遗传性研究的进展。
淋巴瘤诊断先看形态
目前主流的医学观点认为淋巴瘤的正确诊断应该建立在综合性原则基础之上才能做出更为符合实际的正确诊断，即综合分析，它包括形态学特点、免疫表型、临床表现和遗传学特征等在内的信息。
其中，形态学是淋巴瘤诊断的基础：一方面，特征性的形态改变本身就对某些类型的淋巴瘤诊断有决定性的提示作用；另一方面，大部分辅助检查手段都需要在形态学分析的基础上进行合理的选择及使用。而除形态学之外的任何辅助检查的结果，都不应离开形态学而进行淋巴瘤的诊断，否则会存在较大的误诊风险。
举例来说，在B细胞淋巴瘤的形态学分析中，通过细胞体积就可归纳为大细胞（体积大于组织细胞，或为成熟淋巴细胞的2倍及以上）如DLBCL（弥漫大B细胞淋巴瘤），中等大（体积与组织细胞相近或略小）的细胞如BL（Burkitt淋巴瘤），小细胞（体积与正常成熟小淋巴细胞相近，或略大）为主的CLL（慢性淋巴细胞白血病）、SLL（小淋巴细胞淋巴瘤）、套细胞淋巴瘤等等。
如图1a，我们看到小绿豆似的一片，大小都差不多，这就属于小细胞；而图1b中，中等大小，中间有很多的“星空”现象，就高度怀疑是Burkitt淋巴瘤；图1c右则考虑是弥漫大B细胞淋巴瘤。
(a)
(b)
(c)
图1
需要注意的是，在观察淋巴瘤形态时要注意辨别，尤其当组织处理不好，就会导致很多的结构假象和细胞假象，造成诊断的困难。
以免疫组化特点定表型
免疫组织化学检查是一种利用抗原、抗体特异性结合反应来检测组织中有无特定抗原表达的免疫组织化学染色方法。在现如今的淋巴瘤病理诊断中，免疫标记是不可或缺的，其作用主要包括：通过细胞系标志物检测来帮助判断肿瘤细胞类型（例如：B细胞或T细胞淋巴瘤）；通过肿瘤细胞的免疫表型分析并结合形态学来判断细胞所处的发育阶段，从而确定肿瘤的具体类型；检测肿瘤独特的遗传学改变所导致的蛋白异常高表达；协助鉴别淋巴瘤与反应性淋巴组织增生等等。
如图2，我们可以看到CD20、CD5、CD23均呈均匀的膜阳性。CD20阳性，我们考虑B细胞淋巴瘤；CD5、CD23阳性，再结合形态学，我们考虑为CLL/SLL（慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤）
图2
在应用免疫组化诊断淋巴瘤的过程中，需要确保染色质量，且要正确判读免疫组化染色结果。此外要熟悉各类淋巴瘤组织学形态和免疫表型，在形态分析基础上，有所针对地选择必要的抗体组合来证实诊断或帮助鉴别。使用数量庞大的抗体组合不但会造成过度的检测，也往往会扰乱思维，反而为正确的诊断设置障碍。
利用分子生物学技术协助判定良恶性，判断分型、药敏和提示预后
随着遗传学、分子生物学等学科的快速发展，淋巴瘤的诊断已经从形态学和免疫学层面进一步深入到了染色体和基因水平。淋巴瘤的克隆性基因重排、染色体易位等信息对于淋巴瘤诊断的价值不断在提高。
例如在临床工作中，当遇到良恶性难以确定时，就可以通过PCR检测免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因克隆性重排来进行辅助诊断。当某一特定重排的细胞发生克隆性增殖时，该重排基因在混合淋巴细胞中的比例会显著高于其它非克隆增殖的细胞，其相应的PCR产物浓度则会明显高于其它正常细胞的扩增产物。
图3显示的是临床工作中所做的重排，我们认为至少要做到到个bp，才能得到可靠、有参考价值的数据。除此之外，为了进一步保证实验的质量，一定要设立阳性和阴性对照。在结果中我们可以看到有单一峰的存在（红圈处），说明这一标本是单克隆性的。
图3
除了PCR之外，荧光原位杂交（FISH）也越来越多的被应用于淋巴瘤的辅助诊断，其主要用途包括检测多种淋巴瘤亚型中特征性的染色体断裂、易位和相关基因的重排等。如图4，通过MYC双色分离探针可以看到细胞中MYC存在明显的断裂。
图4
但是不是存在MYC断裂就可以诊断为Burkitt淋巴瘤呢？并不然，如我们在一开始所提到的，淋巴瘤诊断先看形态，再以免疫组化特点定表型，如果以上两点都显示Burkitt淋巴瘤的特征，这时荧光原位杂交中的MYC断裂可以帮助我们进一步诊断Burkitt淋巴瘤。如果形态或标记不符合Burkitt淋巴瘤的特征，哪怕有MYC的断裂，我们也不能诊断为BL。
就像图5所示，我们进行淋巴瘤诊断不能从下往上倒推，必须按照从上向下的顺序判断。
图5
以DLBCL的诊断为例来总结我们所推荐的淋巴瘤病理诊断流程
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是成人淋巴瘤中最常见的一种类型，在临床表现和预后等方面具高度异质性。根据最新的WHO淋巴瘤分类要求，我们要在病理诊断中对DLBCL进行细胞起源分类，以应用不同的治疗方案及判断预后。在这里我们就以非特指型DLBCL为例阐述我们对淋巴瘤病理诊断的推荐流程。
在形态学分析之后，我们必须要做免疫组化来进行进一步的诊断。要做的标志物有哪些呢？
首先是Ki-67来看其增殖活性，以及LCA确认其淋巴细胞标记（规范推荐）。接下来我们常规通过CD20,PAX5,CD3这些特异性的标记物鉴别区分B、T淋巴瘤。另外我们一定会做CD21和CD23，以观察滤泡结构。我们还会做CD5、CyclinD1和CD30，这些标记的阳性和预后都是相关的。接下来我们会做CD10，BCL6和MUM-1来确定其起源，生发中心(germinalcenters,GC)的还是非生发中心(non-GC)的，这关系到病人的用药。其中MUM-1不但可以用来确定起源，当MUM-1是阳性时，结合特殊的部位和形态，我们还可以考虑IRF4重排的大B淋巴瘤。再接下来我们还会看有没有双重表达，我们判断的指标是BCL2大于等于50%，MYC大于等于40%，一般而言有双重表达的会比没有双重表达的预后差。另外就是P53，现在P53突变在淋巴瘤中非常有意义，我们会在这里先做蛋白水平的检测。此外由于CAR-T应用的快速发展，我们也会检测CD19，CD22。最后，考虑到国内EB病*感染的高发，我们也会对EBV-EBER进行检测。
在上述的免疫组化检测之后，我们会根据其结果进一步结合分子生物学技术进行诊断。例如当双重表达存在时，我们建议通过FISH来检测双重打击或者三重打击，即MYC，BCL2/BCL6的基因重排。如果在P53蛋白检测中发现了异常，我们就会建议检测TP53基因的突变。在淋巴瘤的诊断中，只有到了这个层面，临床治疗才会一步到位，这也正是“没有明确诊断就没有准确治疗”这一概念在病理诊断中的体现。
结语
近年来，淋巴瘤临床诊治与基础研究均取得了长足的进步，推动着淋巴瘤病理分类不断向前演进，也对淋巴瘤的病理诊断提出了更高的要求。
我们需要做到合理应用多种检测技术，客观判定检查结果，综合评价后给出诊断，加强多学科的沟通，以不断地提高诊疗水平。
专家简介
高子芬教授
北京大学医学部病理学二级教授，博士生导师，主任医师。享受国务院特殊津贴。从事病理教学、医疗和科研工作40余年。
华人检验与病理医师协会副会长、CSCO抗淋巴瘤联盟副主席、CSCO智慧医疗专家委员会委员、中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会常委、《白血病·淋巴瘤》杂志副主任编委、首都医院病理科学科带头人、北京海思特医学检验实验室病理中心特聘专家、首都医科大学临床检验中心特聘专家。
近年来致力于血液病理诊断模式的国际化，积极沟通，统一认识，引导血液肿瘤相关检测技术的结果共享，强化技术环节的质控，推动血液肿瘤诊断与国际接轨，为临床及时提供准确的诊断报告。
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